Réaction en chaîne par polymérase multiplex en temps réel La PCR montre une plus grande sensibilité que la PCR nichée dans les tissus fixés au formol et inclus en paraffine et fournit une méthode efficace pour identifier spécifiquement la fièvre pourprée des montagnes Rocheuses, la rickettsiose et la Rickettsia parkeri rickettsiose en utilisant des échantillons de biopsie cutanée

Contexte Rickettsia rickettsii, Rickettsia parkeri et Rickettsia akari sont les causes les plus fréquentes de rickettsioses de fièvre pourprée indigènes aux États-Unis. Patients infectés caractérisés par une éruption maculopapulaire, souvent accompagnée d’une escarre d’inoculation. Des prélèvements de biopsie sont souvent évaluation diagnostique Cependant, un diagnostic spécifique à l’espèce est rarement réalisé à partir de spécimens pathologiques, car les colorants immunohistochimiques ne différencient pas les agents pathogènes des rickettsies du groupe fièvre pourprée, et les tests PCR en chaîne par polymérase existants ciblent généralement des segments de gènes importants qui peuvent être difficiles ou impossibles. obtenu à partir de tissus fixés au formol Méthodes Ce travail décrit le développement et l’évaluation d’un test PCR multiplex en temps réel pour la détection de ces espèces Rickettsia à partir de spécimens de biopsie FFPE fixés au formol et inclus en paraffineRésultats Le test PCR multiplex était spécifique à distinguer chaque espèce des contrôles FFPE de pathogènes bactériens, viraux, protozoaires et fongiques non apparentés qui causent des lésions cutanées, ainsi que d’autres espèces de Rickettsia du groupe de la fièvre pourprée étroitement apparentéesConclusions Cette PCR multiplex en temps réel démontre une plus grande sensibilité que les tests PCR nested dans les tissus FFPE et fournit une méthode efficace pour identifier spécifiquement les cas de fièvre pourprée des montagnes Rocheuses, de rickettsiespox et de rickettsiose R parkeri en utilisant des échantillons de biopsie cutanée

Rickettsia, PCR en temps réel, biopsies cutanées Groupe de fièvre spondylitaire Rickettsia Les espèces SFGR constituent un vaste et divers assemblage de bactéries Gram négatif intracellulaires obligatoirement présentes dans les puces, les tiques et les acariens. Au moins les espèces SFGR sont endémiques aux États-Unis, y compris Plusieurs agents pathogènes connus Cependant, la plupart des rickettsioses SFG sont causées par Rickettsia rickettsii, Rickettsia akari ou Rickettsia parkeri, les agents étiologiques de la fièvre pourprée des montagnes Rocheuses RMSF, rickettsialpox et R parkeri rickettsiose, respectivement . caractérisé par de la fièvre et un exanthème généralisé, et des échantillons de biopsie cutanée sont souvent obtenus pour établir un diagnostic présuméRickettsia rickettsii est transmise par plusieurs espèces de tiques, y compris Dermacentor variabilis, Dermacentor andersoni et Rhipicephalus sanguineus Plusieurs centaines à plusieurs milliers de cas de RMSF sont signalés chaque année. les États-Unis, principalement du et les États du sud-est RMSF est la rickettsiose SFG la plus sévère; le taux de létalité des infections non traitées peut être>% Une éruption maculopapulaire ou pétéchiale est identifiée chez la plupart des patients, mais une escarre d’inoculation est rarement décrite Rickettsia akari est transmise aux humains par la morsure de la mite domestique Liponyssoides sanguineus Rickettsialpox est plus doux que RMSF et est généralement associé à une escarre d’inoculation et une éruption maculopapulaire qui peut être vésiculaire Aux États-Unis, rickettsialpox existe comme une zoonose urbaine, et presque tous les cas documentés des États-Unis proviennent d’une grande métropole La libération intentionnelle de Bacillus anthracis en tant qu’arme de bioterrorisme dans la sensibilisation accrue des médecins aux maladies associées aux escarres, y compris la rickettsiose Rickettsia parkeri, a été identifiée comme cause de maladie chez les humains. R parkeri et est distribué dans une grande partie du sud-est et le centre des États-Unis atlantique Cette modérément sévère maladie partage des caractéristiques avec RMSF et rickettsialpox, à savoir, l’apparition de ou plusieurs escarres d’inoculation, et une éruption maculopapulaire, parfois avec des composants vésiculaires ou pétéchiaux

La distribution sympatrique des vecteurs de tiques et des espèces de Rickettsia, et les similitudes cliniques et histologiques de ou plus des manifestations cutanées de RMSF, R parkeri rickettsiose et rickettsialpox Figures, et nécessitent l’utilisation de méthodes avancées pour confirmer et distinguer ces infections En outre, divers autres pathogènes viraux, bactériens, fongiques ou protozoaires peuvent provoquer des lésions d’escarre ou d’éruption qui sont cliniquement ou histologiquement similaires à celles provoquées par les SFGR Les techniques de coloration immunohistochimique sont utiles pour confirmer les rickettsioses SFG; cependant, ces essais ne sont pas spécifiques à l’espèce L’identification spécifique des espèces est rarement réalisée à partir de spécimens FFPE fixés au formol et inclus en paraffine , car des segments relativement importants de cibles génétiques particulières sont utilisés classiquement pour établir un diagnostic moléculaire. La confirmation spécifique à l’espèce des échantillons de biopsie FFPE est particulièrement difficile car la formol provoque une fragmentation des acides nucléiques qui limite de façon caractéristique la taille des amplicons PCR amplifiés , et les biopsies cutanées fournissent généralement des quantités relativement faibles de pathogènes. ADN pour l’analyse moléculaire Ce travail a été initié pour développer un test de PCR en temps réel fiable pour amplifier des fragments d’ADN petits mais spécifiques du SFGR pathogène le plus fréquemment rencontré aux États-Unis à partir de spécimens de biopsie FFPE. l’escarre d’inoculation de Ricket Cliniquement, les deux lésions sont caractérisées par une croûte nécrotique de – à – cm entourée d’un halo érythémateux A et B Microscopiquement, elles présentent des caractéristiques indiscernables comprenant une nécrose de l’épiderme et du derme supérieur, une hémorragie, infiltrats de cellules inflammatoires neutrophiliques et lymphohistiocytaires périvasculaires accompagnés de thrombus occlusifs de fibrine C et D hématoxyline et coloration à l’éosine, grossissements d’origine × Figure Agrandir l’imageRésolution clinique et histologique entre l’escarre d’inoculation de Rickettsia parkeri rickettsiose A et C et rickettsialpox B et D Cliniquement, les deux Au microscope, ces lésions sont caractérisées par une nécrose de l’épiderme et du derme supérieur, une hémorragie et des infiltrats de cellules inflammatoires péri-vasculaires neutrophiles et lymphohistiocytaires, accompagnées d’une croûte nécrotique de – à -cm entourée d’un halo érythémateux. par thrombus occlusifs de fibrine C et D coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, grossissements d’origine × Figure Agrandir les imagesCoupures cliniques et histologiques parmi les éruptions de fièvre pourprée des montagnes Rocheuses A et D, Rickettsia parkeri rickettsiose B et E et rickettsialpox C et F éruption maculopapulaire érythémateuse A-C Les caractéristiques histologiques de ces éruptions cutanées sont souvent assez similaires et sont caractérisées principalement par infiltrats lymphocytaires inflammatoires péri-vasculaires lymphohistiocytaires C-E hématoxyline et éosine tache, grossissements d’origine × Figure Agrandir la photoTableaux cliniques et histologiques parmi les éruptions de Rocky Mountain repéré fièvre A et D, Rickettsia parkeri rickettsiose B et E, et rickettsialpox C et F Chaque infection peut présenter une éruption maculo-papuleuse érythémateuse A-C Les caractéristiques histologiques de ces éruptions sont souvent assez similaires et sont caractérisées principalement par l’infusion lymphocytaire périvasculaire inflammatoire cellulaire taux de coloration de l’hématoxyline et de l’éosine C-E, grossissements originaux ×

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Sélection et préparation des contrôles

a chaffeensis – – – – – – Anaplasma phagocytophilum – – – – – – Burkholderia pseudomallei – – – – – – Espèces de Leptospira – – – – – – Salmonella typhi – – – – – – Leishmania mexicana mexicana – – – – – – Humain herpèsvirus – – – – – – Herpèsvirus humain – – – – – – Herpesvirus humain – – – – – – Virus Orf – – – – – – Nom Dosages PCR en temps réel Dosages PCR conventionnels Citrate Synthase gltA Gène R rickettsii Protéine Hypothétique Gène R parkeri ompB Gène R akari ompB Gène ompA Gène kDa Antigène Gène R akari souche Columbia – – -a -a R parkeri souche Deep Creek – – R australis souche NQTT – – – -a R rickettsii souche AZ- – – R felis souche LSU – – – -a R conorii souche # – – – R massiliae souche Mt ATCC VR- – – – -a R africae souche Z-Hu – – – R souche sibirica ATCC VR- – – – souche « R amblyommii » Darkwater – – – Bacillus anthracis – – – – – – Francisella tularensis – – – – – – – – – – Pseudomonas aeruginosa – – – – – – Sporothrix schenckii – – – – – – Staphylococcus aureus – – – – – – Capnocytophaga canimorsus – – – – – – Neisseria meningitidis – – – – – – Ehrlichia chaffeensis – – – – – – Anaplasma phagocytophilum – – – – – – Burkholderia pseudomallei – – – – – – Espèces de Leptospira – – – – – – Salmonella typhi – – – – – – Leishmania mexicana mexicana – – – – – – Humain herpèsvirus – – – – – – Herpesvir humain us – – – – – – Virus de l’Orf – – – – – – Orf virus – – – – – – Abréviation: PCR, réaction en chaîne par polymérasea Résultat attendu basé sur le mésappariement des amorces Les spécimens cas-patient pour évaluation comprenaient des échantillons de biopsie cutanée FFPE soumis à la Direction de pathologie des maladies infectieuses des centres de contrôle et de prévention des maladies au cours des années par des tests positifs d’infection par une espèce SFGR par coloration immunohistochimique IHC Parmi cet ensemble d’échantillons pour lesquels un diagnostic spécifique à l’espèce était disponible par culture ou gène ompA imbriqué Évaluation par PCR de tissus frais, de sang ou d’un autre échantillon Les échantillons restants ont été sélectionnés en fonction de caractéristiques cliniques et épidémiologiques compatibles avec un diagnostic présomptif de RMSF, de R parkeri rickettsiose ou de rickettsiose. Évaluation de la réaction de la biopsie de la peau fixée au formol et incluse dans de la paraffine Désignation des cas Avant l’analyse PCR en temps réel Tests PCR en temps réel Tests PCR nichés conventionnels Citrate synthase gltA Gène R rickettsii Gène protéique hypothétique R parkeri Soumis aux Centers for Disease Control and Prevention ompB Gène R akari ompB Gène ompA Gène kDa Antigène Gène Rocky AZ Confirmé – – – Mountain CR Confirmé – – – fièvre pourprée MX Suspecté – – – – MX Confirmé – – – – Rickettsia AL Confirmé – – parkeri GA Confirmé – – rickettsiose MS Confirmé – – – MS Confirmé – – – – SC Confirmé – – – – SC Suspectedb – – – TX Confirmé – – – – TX Suspecté – – – – VA Suspecté – – – Rickettsialpox MD Suspectedc – – – – NY Confirmé – – – – NY Suspecté – – – – NY Confirmé – – – – NY Suspecté – – – – NY Suspecté – – – – NY Suspecté – – – – NY Suspecté – – – – NY Suspecté – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – Fièvre africaine de piqûre de tique AL Confirmé – – – FL Confirmé – – – PA Confirmé – – – MD Confirmé – – – Rickettsia D rickettsiose CA Confirmé – – – – Désignation des cas Maladie Avant l’analyse PCR en temps réel Tests PCR en temps réel Tests PCR nichés conventionnels Citrate synthase gltA Gène R rickettsii Gène protéique hypothétique R parkeri ompB Gène R akari ompB Gène ompA Gène kDa Antigène Gene Rocky AZ Confirmé – – – Mountain CR Confirmé – – – fièvre pourprée MX Suspecté – – – – MX Confirmé – – – – Rickettsia AL Confirmé – – parkeri GA Confirmé – – rickettsiose MS Confirmé – – – MS Confirmé – – – – SC Confirmé – – – – SC Suspectedb – – – TX Confirmé – – – – TX Suspecté – – – – VA Suspecté – – – Rickettsialpox MD Suspecté – – – – NY Confirmé – – – – NY Suspecté – – – – NY Confirmé – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – NY Suspecté – – – – NY Soupçonné – – – – NY Soupçonné – – – – Fièvre africaine de piqûre de tique AL Confirmé – – – FL Confirmé – – – PA Confirmé – – – MD Confirmé – – – Rickettsia D rickettsiose CA Confirmé – – – – Abréviation: PCR, amplification en chaîne par polymérase Confirmée indépendamment par isolement de culture à partir de sang ou de tissus frais ou par PCR conventionnelle Coloration bactérienne et épidémiologiquement compatible avec un groupe de fièvre pourprée Espèce de Rickettsia par immunohistochimieC Susceptible initialement d’être une rickettsiose R parkeri

Extraction d’ADN

Des coupes de quatre pm ont été découpées dans chaque bloc de paraffine et placées dans un tube de microcentrifugeuse. Les coupes ont été déparaffinées avec du xylène et lavées deux fois avec de l’éthanol absolu. Les tissus ont été incubés pendant une nuit à 0 ° C. le surnageant a été complété en utilisant un Qiagen QIAamp DNA Micro Kit et le protocole « Tissues » du fabricant, avec un volume d’élution final de μL

Dosages moléculaires

Les séquences d’amorces et de sondes pour la PCR en temps réel sont listées dans le tableau. Pour la détection de SFGR, des amorces de PCR en temps réel ciblant le gène glutA de la citrate synthase ont été utilisées La réaction consistait en μL de Qiagen QuantiTect Multiplex PCR les amorces directe et inverse, μM de la sonde, et μL d’extrait d’ADN dans un volume de -μL Les conditions de cyclage consistaient en un cycle de ° C pendant minutes, et des cycles de ° C pendant secondes et ° C pendant secondes en utilisant un Agilent Santa Clara, Thermocycleur en temps réel California MxP Cibles de table et séquences d’amorces et de sondes utilisées dans cette étude Cibler la séquence de référence Espèce de Rickettsia citrate synthase gltA gène TCG CAA ATG TTC ACG GTA CTT TTCG TGC ATT TCT TTC CAT TGT GFAM-TGC AAT AGC AAG AAC CGT AGG CTG GAT G-BHQ Rickettsii gène de la protéine hypothétique AAA TCA ACG GAA GAG CAA AACCCC TCC ACT ACC TGC ATC ATCY-TCC TCT CCA ATC AGC GAT TC-BHQ R parkeri ompB gène CAA ATG TTG CAG TTC CTC TAA ATGAAA ACA AAC CGT T AA AAC TAC CGFAM-CGC GAA ATT AAT ACC CT AT AT AGC AGC AGT CGC G-BHQ R akari ompB gène GTG GTG CTG TTG CAG GTG GTTG CTC CAC CGA GAG TTA ATG TTHEX-CGG TGC TGG TAA TGC TGC ATT ACA CG- BHQ Cette étude Cible ‘to’ Séquence de référence Rickettsia espèces citrate synthase gltA gène TCG CAA ATG TTC ACG GTA CTT TTCG TGC ATT TCT TTC CAT TGT GFAM-TGC AAT AGC AAG AAC CGT AGG CTG GAT G-BHQ R rickettsii gène de la protéine hypothétique AAA TCA ACG GAA GAG CAA AACCCC TCC ACT ACC TGC ATC ATCY-TCC TCT CCA ATC AGC GAT TC-BHQ R parkeri ompB gène CAA ATG TTG CAG TTC CTC TAA ATGAAA ACA AAC CGT TAA AAC TAC CGFAM-CGC GAA ATT AAT ACC CTT ATG AGC AGC AGT CGC G-BHQ R akari ompB gène GTG GTG CTG TTG CAG GTG GTTG CTC CAC CGA GAG TTA ATG TTHEX-CGG TGC TGG TAA TGC TGC ATT ACA CG-BHQ Cette étude Amorces et sondes ciblant une protéine hypothétique Le gène du génome R rickettsii et les gènes ompB de R parkeri et R akari ont été multiplexés en un seul essai en temps réel sur tube. e composé de μL de Qiagen QuantiTect Multiplex PCR Master Mix, μM de chacune des amorces et sondes directes et inverses, et μL d’extrait d’ADN dans un volume de -μL Les conditions de cyclage consistaient en un cycle de ° C pendant minutes et cycles de ° C pour secondes et ° C pour secondes en utilisant un thermocycleur Agilent MxP en temps réel Toutes les réactions de PCR comprenaient des contrôles positifs et négatifs appropriés, et les échantillons étaient considérés positifs si la valeur du seuil de cycle était ≤ pour chacune des cibles respectives. gène et le gène de l’antigène kDa ont longtemps été considérés comme l’étalon moléculaire de référence pour la détection SFGR et ont été utilisés dans ce travail comme comparaison avec les tests PCR en temps réel. La PCR ompA a été réalisée comme décrit précédemment. a été réalisée en utilisant les amorces TZ et TZ au stade primaire, et un kit PCR High Fidelity PCR de Roche Indianapolis, Indiana avec des concentrations d’amorce finale de nmol et un extrait d’ADN de pl dans un volume de réaction de -μL. Les réactions ont été dénaturées à ° C pendant des minutes; puis soumis à des cycles de ° C pendant quelques secondes, ° C pendant des secondes et ° C pendant des secondes; et une extension finale à ° C pendant quelques minutes. L’étage héminesté a produit un amplicon -bp avec les amorces TZ-FN ‘-TTG TBG GAG TAG GTG TAG et TZ, et la réaction a utilisé μL de la réaction PCR primaire et les mêmes conditions de cycle que ci-dessus Les tests PCR ont été purifiés sur gel d’agarose à l’aide d’un kit Qiagen QiaQuick Gel Extraction Kit Le séquençage du cycle des éluats a été réalisé en utilisant le logiciel Quick Start DTCS Master Mix Beckman Coulter, Indianapolis, Indiana Les réactions ont été purifiées en utilisant un kit Qiagen DyeEx Spin, concentrées par centrifugation sous vide, mises en suspension dans des ul de solution de chargement d’échantillon Beckman Coulter et placées sur un GenomeLab GeXP Beckman Coulter pour séquençage. Des séquences nucléotidiques consensuelles ont été analysées en utilisant CLC Main Workbench Cambridge, Massachusetts et National. Programme d’outil de recherche de base sur l’alignement local du Centre for Biotechnology Information http: // blastncbinlmnihgov

RÉSULTATS

Le test PCR multiplex a correctement identifié tous les contrôles cellulaires pour R rickettsii, R parkeri et R akari. Aucune réaction faussement positive n’a été détectée avec l’un des contrôles de culture cellulaire infectés contenant d’autres espèces de Rickettsia ou d’autres pathogènes viraux, bactériens, fongiques ou protozoaires. Comme prévu, les extraits d’ADN de R massiliae, R felis et R australis n’ont pas produit d’amplicons avec l’ensemble d’amorces ompA [,,], et l’ADN extrait de R akari n’a pas produit d’amplicons avec l’ensemble d’amorces ompA ou kDa. des mésappariements entre les séquences nucléotidiques extraites de spécimens de biopsie cutanée FFPE provenant de cas d’infection par R parkeri confirmée par culture ou confirmée par ompA ont été testées avec le test PCR en temps réel; tous les cas étaient positifs pour R parkeri et négatifs pour R rickettsii et R akari Trois cas confirmés de RMSF mortelle et des cas confirmés de rickettsialpox étaient positifs pour leurs cibles respectives et négatifs pour les cibles des autres espèces Rickettsia extraits d’ADN de biopsies FFPE obtenues de patients avec une PCR confirmée par PCR avec Rickettsia D étaient positifs lors du test du gène de la Rickettsia citrate synthase gltA , mais négatifs pour R parkeri, R rickettsii et R akari lorsqu’ils sont testés par l’analyse PCR multiplex en temps réel Plusieurs cas d’infection présumée SFGR ont également été analysés pour déterminer une espèce causale Chacun des cas suspectés était négatif par gène d’antigène ompA et kDa PCR D’après leur origine géographique et leurs caractéristiques cliniques, l’évaluation incluait des cas suspects de rickettsiosepox de New York, des cas suspects de rickettsiose R parkeri du Maryland, Caroline du Sud, Texa Virginie, et cas suspect de RMSF mortel au Mexique Tous les cas suspects étaient positifs par PCR en temps réel gltA, indiquant la présence d’ADN rickettsial. Le cas suspect de RMSF était positif pour la cible protéique hypothétique Rickettsii seulement Tous les cas de rickettsiespox suspectés étaient positifs uniquement pour le gène R akari ompB dans le test en temps réel Des cas suspects de R parkeri rickettsiose, seuls les tests en temps réel du gène R parkeri ompB ont été positifs Le quatrième cas suspect était positif pour le R akari ompB gène

DISCUSSION

Cette étude est la première à utiliser un test PCR multiplex en temps réel pour la détection de Rickettsii, R akari et R parkeri dans des spécimens de biopsie FFPE provenant de cas confirmés par culture et PCR, R parkeri, R rickettsii et R akari ont été identifiés avec succès Nous avons été en mesure de déterminer une espèce causale en utilisant le test PCR en temps réel dans des biopsies de plusieurs cas suspects d’infection par SFGR IHC-positive Un cas de rickettsiose SFG chez une femme du Maryland a été suspecté a été découvert de manière inattendue comme étant positive pour R akari L’identification précise de l’espèce Rickettsia infectante est cruciale pour établir des distributions valides et les conséquences cliniques associées aux rickettsioses SFG , et il existe probablement de nombreux exemples d’associations incorrectes basées sur des espèces non spécifiques. Il existe certaines limites à cette méthode. L’analyse immunohistochimique d’échantillons de biopsies cutanées révèle que les antigènes rickettsiens ne sont pas uniformément répartis dans tout le tissu Alors qu’une section de tissu peut contenir un antigène et un acide nucléique abondants, une coupe de tissu plus profonde dans le bloc FFPE peut avoir nettement moins d’acide nucléique rickettsial disponible pour l’analyse Exposition du bloc FFPE à l’air ou fixation prolongée de l’échantillon de tissu dans le formol peut également affecter la qualité et la quantité d’acide nucléique disponible pour l’amplification Le moment de la procédure de biopsie au cours de l’infection et l’intervalle entre l’administration d’un antibiotique approprié et la doxycycline avant la biopsie quantité d’acides nucléiques amplifiables dans l’échantillon de biopsie Ce test multiplex a confirmé l’espèce infectante SFG Rickettsia chez les patients qui n’auraient pas été connus autrement; Néanmoins, les infections causées par d’autres espèces de Rickettsia endémiques aux États-Unis, telles que Rickettsia espèces D et R felis et celles associées aux voyages à l’étranger, comme R africae , ne sont pas spécifiquement identifiées par ce test multiplex reflétant La fixation des échantillons de biopsie cutanée permet une analyse histologique et IHC, mais en raison de la réticulation et de la fragmentation des acides nucléiques, la réalisation de PCR sur des échantillons FFPE peut être difficile en raison de les amplicons de grande taille et les protocoles de PCR nichés nécessaires pour obtenir des données de séquençage suffisantes pour la différenciation des espèces de Rickettsia coup de soleil. Ces processus prennent aussi beaucoup de temps. En développant ce test PCR multiplex en temps réel, un diagnostic spécifique de l’espèce peut être obtenu dans & lt; heures, par rapport aux ≥ heures nécessaires pour amplifier et séquencer les produits obtenus par PCR nichée conventionnelle. Ce test PCR multiplex temps réel a été développé pour évaluer les acides nucléiques extraits des échantillons de biopsie FFPE, mais il est également possible que ces méthodes puissent être efficacement adaptées. pour l’utilisation sur une variété d’autres types d’échantillons La détection de l’ADN rickettsial a été de plus en plus signalée en utilisant des écouvillons d’escarres , et la PCR quantitative du tampon recueilli quelques semaines après le début de l’antibiothérapie peut confirmer dans certains cas Nous avons également appliqué avec succès ce test multiplex pour obtenir des diagnostics spécifiques d’espèces à partir d’autres types de tissus FFPE données non publiées. En conclusion, cette PCR multiplex en temps réel établit une méthode rapide pour distinguer ces infections d’autres causes infectieuses d’escarres et d’éruptions cutanées. maladies associées, et peut fournir des informations plus précises sur la distribution et les caractéristiques cliniques de ces rickettsioses en établissant un diagnostic spécifique à l’espèce

Remarques

Remerciements Nous remercions Maureen G Metcalfe pour la section des blocs FFPE et pour la révision du manuscritDisclaimer Les résultats et les conclusions sont ceux des auteurs et ne représentent pas nécessairement la position officielle des Centers for Disease Control et Prevention Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: No reported ConflitsTous les auteurs ont soumis le formulaire ICMJE pour la divulgation des conflits d’intérêts potentiels Conflits que les éditeurs considèrent pertinents pour le contenu du manuscrit ont été divulgués